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石蜡切片免疫组化染色实验操作流程@赛培动态

点击次数:156   发布时间:2019/5/15 15:11:56

1.石蜡切片脱蜡至水:(石蜡切片染色前应置 60℃ 1 小时) 。


① 二甲苯 •●、II,各 10 分钟。
② 梯度酒精:100%,2 分钟 95%,2 分钟 80%,2 分钟 70% 2 分钟。
③ 蒸馏水洗:5 分钟,2 次(置于摇床)。

2.过氧化氢封闭内源性过氧化物酶:3%H2 O2 ,室温 10 分钟(避光) 。

3.蒸馏水洗:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

4.抗原修复:根据待检测的抗原,选择适当的方法。

附:抗原修复液(10mMpH 6.0 枸橼酸钠缓冲液)的配制:① 储备液的配制:A 液:枸橼酸三钠- 2H2O 29.41g + 蒸馏水 1000ml;B 液:枸橼酸 21g + 蒸馏水 1000ml;② 工作液的配制:A 液 82ml+ B 液 18ml+ 蒸馏水 900ml

抗原修复的方法: ① 高压锅处理技术:枸橼酸钠缓冲液(10mM,PH6.0),淹没切片,盖上锅盖,高压锅内煮沸,上汽 3 分钟后缓慢冷却(可用自来水在高 压锅外冲,以助冷却) 。② 微波处理技术:用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内,枸橼酸 钠缓冲液淹没切片,选择中高或高档,5 分钟;取出并补充已预热的 枸橼酸钠缓冲液; 再选择中高或高档,5分钟(.*佳温度为 92 95℃)③ 酶消化处理。

抗原修复的注意事项:① 组织不能干。 ② 选择抗原修复方法要因抗体而异。 ③ 该方法主要用于 10%福尔马林固定•●、石蜡包埋组织。④ 抗原修复后至 DAB 显色的过程中,均需用 PBS 缓冲液。

5.PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

6.正常血清封闭:从染片缸中取出切片,擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分 (保持组织呈湿润状态,)滴加正常山羊或兔血清 (与第二抗 体 同源动物血清)处理,37℃,15 分钟。

附:正常血清配制 ( 或按试剂盒规定的浓度配制):按 1:20比例,用 PBS 配制,每张切片需要量按 50μ+5μl (10%抛洒量) 计算。

7.滴加*抗体:用滤纸吸去血清,不洗,直接滴加*抗体,37℃ 2 小时(也可置于 4℃冰箱过夜) 。

8.PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

9.滴加生物素化的二抗,37℃,40 分钟。

10.PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

11.滴加三抗 (SAB 复合物) ,37℃,40 分钟。

12.PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

13.DAB 显色,镜下观察,适时终止(自来水冲终止) 。

附:DAB 的配制① 储备液(DAB 25mg/ml)的配制:DAB 250mg + PBS 10ml,待完全溶解后分装成 1ml,100μl,50μl ,20μ l 等,-20℃,冻存。② 工作液:DAB 储备液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl

14.自来水(细水)充分冲洗。

15.苏木素复染,室温,30 秒,自来水冲洗。

16.自来水冲洗返蓝,15 分钟。

17.梯度酒精脱水:80%,2 分钟 95%,2 分钟 100%,2 次,5 分钟。

18.二甲苯透明:I ,II (二甲苯)各 5 分钟。

19.封片:加拿大树胶(或中性树胶)封片。

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